合成聚合物为人类社会提供了众多便利，聚对苯二甲酸乙酯(PET)作为使用最广泛的合成塑料之一，全球产量超过8200万吨。然而，由于其化学惰性，对苯二甲酸乙二醇酯（PET）降解速度缓慢，导致其在环境中大量积累。传统的化学回收方法存在高温高压、有毒催化剂和危险化学品的问题。与之相反，酶法降解由于在温和条件下进行，更符合可持续发展理念。近年来，PETase的研发已经取得了显著的进展，一种机器学习设计的PETase变体FAST-PETase已被设计用于在50°C下高效降解各种消费后PET塑料。然而，没有报道过耐热MHETase能够在50°C下匹配FAST-PETase，因此，现有MHETase的活性和稳定性限制了其在PET回收中的应用。
图1. PETase和MHETase降解PET示意图
2023年11月9日，来自北京化工大学生命科学技术学院的朱玉山教授和清华大学化学工程系卢滇楠教授团队在《Communications Biology》杂志发表了题为“Computational design of highly efficient thermostable MHET hydrolases and dual enzyme system for PET recycling”的研究论文，该研究成功设计出具有高活性和耐热性的MHET水解酶（KLMHETase，Tm = 67.58℃），并通过将KLMHETase与FAST-PETase构建为融合双酶系统（KL36F），降解效率提升至2.6倍，在100 g/L底物浓度的大型反应体系中，实现了90%以上的PET解聚成单体，显著提高了PET的回收效率。
首先，基于实验室先前开发的活性位点匹配算法ProdaMatch，该团队从热稳定蛋白骨架库中筛选出5种排名最高的耐热性蛋白骨架(1EVQ、1TQH、5FRD、4UHF、2C7B)进行实验测试(图2b-f)，这5个骨架均可表达，其中两个骨架，即1EVQ和1TQH，在MHET水解方面表现出明显的活性，活性分别是FAST-PETase的1.27倍和1.33倍(图2h)。此外，与1EVQ相比，1TQH在PET降解方面几乎没有活性(图2i)，后者的PET降解活性仅为FAST-PETase的1/7，这表明1TQH在MHET水解方面具有更高的特异性。因此，选择1TQH作为改造骨架进行下一步的设计。
图2. 热稳定MHETase骨架选择和MHET降解测试基于1TQH热稳定骨架，研究人员随后建立了MHET水解的计算机制模型，同时重新设计活性位点并稳定过渡态（TS）构象，共生成了704个突变体序列，其中包括单点、双点和三点突变。这些序列根据酶-过渡态复合物的能量进行排序。经过计算，超过70%的序列（512/704）具有比野生型更低的结合能。之后又进行了两轮高通量分子动力学模拟，以及长时间的分子动力学模拟，最终根据计算的结合能变化、折叠能变化、催化指标和序列的多样性等因素，选定了14个设计变体进行实验验证(图3a)。
图3. 1TQH降解MHET突变体的计算设计以及实验验证
在50℃和pH=7.5条件下，通过测定WT酶和14种变体对MHET水解的动力学参数，发现其中大多数变体（11/14）的催化效率较WT有所提高。其中，变体M8（I171K/G130L）、M13（I171K/M127S/G130F）和M14（I171K/M127S/G130L）的催化活性分别是WT的36.0、62.1和96.3倍。通过差示扫描量热法（DSC）测定，所有变体的蛋白熔化温度（Tm）除了M1（G130L）之外都降低，但所有变体都能够正常表达。研究人员还对最活跃的变体M14进行了晶体结构测定，与WT酶相比，二者活性位点结构基本一致，证明计算工具PRODA在一定程度上能够容忍蛋白骨架的波动。实验结果表明，虽然一些突变体在稳定性上有所牺牲，但它们在催化活性上取得了显著的提升(表1)。
表1. 1TQH突变体的Tm值以及动力学参数测定
为了提高对PET的降解效率，研究人员利用FAST-PETase和设计的MHETase的协同效应，构建了一个双酶融合系统。通过在FAST-PETase和设计的MHETase之间构建适当的连接器并优化融合顺序，可以充分暴露FAST-PETase的活性位点，从而提高对PET聚合物底物的催化效率。研究中使用了一系列长度不同的柔性甘氨酸和丝氨酸连接器（L20、L28和L36）以及一个刚性连接器（L4），通过共价连接将KL-MHETase或KLS-MHETase的C末端与FAST-PETase的N末端相连，共构建了八种融合酶。在50℃下使用Pc-PET粉末底物进行了12或24小时的实验，实验结果显示，这八种融合双酶系统的PET降解活性强烈依赖于PETase和MHETase之间的融合顺序、连接肽的氨基酸序列以及长度。其中，三种融合双酶系统KL20F、KL28F和KL36F在24小时内表现出比单一酶FAST-PETase更高的转化率。通过使用蛋白质结构预测工具AlphaFold2，研究人员预测了这八种融合双酶系统的复合物结构，结果显示KL20F、KL28F和KL36F中FAST-PETase的底物结合裂缝完全暴露，并且这些融合酶中KL-MHETase的活性位点朝向FAST-PETase的活性位点。长时间的分子动力学模拟验证了KL36F中两个酶的活性位点的方向。这有助于PET降解中间产物MHET直接扩散到KL-MHETase的活性位点，降解为TAP和EG，消除了MHET对FAST-PETase的抑制作用，促进了酶的协同作用，提高了催化效率。
图4. FAST-PETase和KL-MHETase融合双酶体系降解PET最后，研究人员比较了FAST-PETase和KL36F在大型反应系统中的性能，KL36F在60小时内实现了90%的PET转化率和89.0%的TPA产率，分别比FAST-PETase高1.9倍和1.8倍。KL36F的TPA产品中TPA的纯度超过99%，MHET的浓度最高为4mM。与之相比，在单一酶系统中，MHET的浓度达到20mM，这可能导致FAST-PETase的产物抑制，PET降解的转化率停滞在53%。这些结果表明，KL36F在高底物浓度下仍保持其优越性能，显示了其在PET的工业回收中的潜在应用。
图5. 生物反应器中FAST-PETase和KL36F降解PET的时间进程
总之，该研究通过计算酶设计和优化，在具有挑战性的PET（聚对苯二甲酸乙二酯）降解过程中设计了高效和热稳定的MHETase，并且为了克服PETase在MHET存在下的降解效率低的问题，设计了一个融合的双酶系统KLMHETase-FASTPETase，成功提高了PET的降解效率，该研究成果有望推动PET塑料的工业回收，为可持续循环经济做出贡献。
